为什么我们有时候跑出来的wb条带总是千奇百怪、不尽人意……在上期内容中，我们介绍6种常见的WB实验问题以及相应的解决方案，本期我们将继续分享6种常见的实验现象以及解决方案。

7、可以看到条带，但泛白

✅可能原因:

样品蛋白浓度过高，导致信号过强; 

一抗or二抗浓度过高，信号过强，曝光过度，导致反白现象;

曝光时间过⻓，也可能导致图像过曝，呈白色发光。

❗️解决办法:

• 降低上样量，或者稀释样品;
• 稀释一抗or二抗，根据实际情况判断是哪种试剂浓度过高; 
• 稀释发光液，可以用TBST或PBS稀释，或者换低敏发光液。

8、膜上有黑斑

✅可能原因:

PVDF/NC膜存在污染; 

封闭液污染，或者封闭膜的容器不干净，有脏东⻄; 

未充分激活膜，或者局部激活后又干燥过。

❗️解决办法:

 封闭盒，抗体孵育盒使用前冲洗干净;

 手套保持干净，尽可能不要碰到膜的正面;

 膜使用前充分激活，由白色变半透明即可使用，不要放置在外面使其过久使其干燥。

9、蛋白marker被染色

✅可能原因:

一抗与marker非特异性结合，若像

示例图一样，条带清晰，建议更换marker，一抗不用换; 

若条带不清晰，marker也被染色，建议更换一抗。

❗️解决办法:

• 更换一抗或者蛋白marker，此为预染蛋白和抗体非特异性结合。

10、无条带，白板现象

❗️解决办法:

•  活性较强的蛋白提取时加抑制剂;
•  丰度较低的蛋白增加上样量，制备蛋白样品时多收点细胞;
•  转膜注意过程，插电前仔细确认正负极;
•  使用超敏发光液。

11、最左侧or最右侧条带形状不一致，翘边

✅可能原因:

边缘效应，胶的最左侧or最右侧上蛋白样品导致，如图所示：

上图15孔胶第一个泳道上样后导致翘边，

下图15孔胶第一个泳道上蛋白marker，样品从 第二个泳道开始，则没有这个问题。

❗️解决办法:

• 最左侧or最右侧空开，不上样品，可以补loading buffer; 
• 最左侧or最右侧上蛋白marker。

12、封闭效果不佳，且有气泡

✅可能原因:

转膜三明治结构出现气泡; 

封闭液用量不足或浓度过低; 

封闭时间过短;

封闭液选择不当; 

(不同的蛋白可选择不同的封闭液，例如磷酸化 蛋白不建议使用脱脂奶粉) 

发光液没有充分浸泡PVDF/NC膜。

❗️解决办法:

• 转膜时仔细赶走膜与胶之间的气泡; 
• 脱脂奶粉封闭时可适当提高浓度，例如6%; 
• 封闭完可用tbst漂洗10min后再敷一抗;